Small:高通量、单细胞精度的活细胞力学检测生物芯片及应用

活体微环境中细胞不断受到诸如拉力、静水压力和剪切力等物理力的作用。细胞对于外界信号的感知和响应是细胞的自我调节以适应和应答外界环境机械力的变化的一种重要机械特性。例如,在肿瘤微环境中,空间结构、张力强度、弹性系数等发生变化时,癌细胞会做出相应的调节以改变自身的机械特性,一方面通过驱动并调整细胞形状、骨架结构以及粘附亲和度,产生特定适应性行为,如侵袭、迁移等;另一方面通过激活特定基因程序,改变细胞核中DNA转录,激活相应信号通路,并最终触发耐药性机制。了解和研究细胞力学性质对细胞分离、疾病诊断、免疫状态分析和药物筛选等至关重要。目前,最常用的测量单细胞机械力学性能的方法主要分为两大类:(1)通过操纵光束或悬臂来对细胞施加机械刺激,测量相关的力曲线,以获得细胞的机械反馈,包括原子力显微镜、光镊和磁镊等。(2)采用随机分布荧光粒子的衬底变形来绘制大型细胞的力学分布,包括牵引力显微镜和微柱阵列检测传感器等。然而,复杂的计算和“1个细胞/试验”的吞吐量决定了它们在基于大量细胞的临床分析方面的能力有限。

近日,北京航空航天大学常凌乾课题组通过精确设计阵列化、图形化的单细胞微孔阵列芯片,保证高通量细胞定向操纵(单次可达106个细胞/芯片),从细胞数量上达到群体细胞行为研究的要求,满足统计学意义。同时,可寻址并精确控制和追溯单细胞,是常规技术无法达到的。微孔底部修饰了一种用于荧光成像的DNA张力传感器,用于细胞机械力的高分辨成像。该DNA张力传感器可以通过修饰的胆固醇自发地嵌入细胞膜,在外界环境的刺激下,细胞机械特性的变化通过DNA张力传感器诱导发夹结构的变化,导致荧光基团和淬灭基团的分离,从而产生荧光信号。该DNA张力传感器可以通过调节发夹结构的长度与序列对所测的阀值进行调控,其测量精度可达到pN级。

图1. 高通量DNA张力传感器平台用于研究单细胞的力学异质性的原理图

研究结果表明耐药性肿瘤细胞与非耐药性肿瘤细胞之间存在明显的机械异质性。相比非耐药性肿瘤细胞,对于化疗药物紫杉醇具有一定抗性的耐药性肿瘤细胞的硬度降低,细胞机械力引起的荧光信号升高。为了进一步分析导致单细胞机械异质性的原因,我们通过单细胞RNA测序技术证实了两个细胞群之间潜在的遗传异质性,结果显示耐药性细胞中与细胞骨架重塑有关的两种基因VEGFA和MINK1的表达量普遍增加。随后,我们通过将siVEGFA和siMINK1转染到耐药性肿瘤细胞中,下调了这两个基因的表达水平。最终,该平台检测结果显示,伴随着相关基因表达量的下调,耐药性肿瘤细胞的荧光信号明显下降,证实了VEGFA和MINK1与耐药性细胞机械力增加的机制呈正相关,提示VEGFA和MINK1可能参与了肿瘤细胞形成耐药性过程中的机械调控。

图2.耐药性和非耐药性肿瘤细胞的机械力的成像与分析

为了评估该平台的临床应用价值,我们收集了10个肺癌组织的原发肿瘤细胞样本和5个肺癌胸腔积液中肿瘤细胞样本。基于肿瘤细胞生物标志物上皮细胞黏附分子免疫荧光染色对肿瘤细胞进行筛选。随后,使用该平台对筛选完成的肿瘤细胞进行了机械特性的检测。通过比较每个单细胞的荧光信号,统计结果显示,肺癌组织原发细胞的机械力明显低于胸腔积液肿瘤细胞,这与其他报道的转移性肿瘤细胞比非转移性肿瘤细胞具有更高的机械力的结果一致。另外,我们使用qPCR对10个肺癌组织样本和5个胸腔积液样本VEGFA和MINK1的表达量进行了检测,与非转移性肿瘤细胞相比,转移性肺癌细胞中VEGFA和MINK1表达量相对较高。这一结果证实了该平台可以根据力学异质性有效地区分非转移性肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞,从细胞机械特性的角度支持了该平台在临床研究肿瘤转移方面的潜力。

图3. 临床肿瘤细胞样本中发生转移的肿瘤细胞与未转移肿瘤细胞的机械力特性

该研究第一作者是北航博士生杭欣欣,硕士生何诗琦和董再再博士。第一单位为北京市生物医学工程高精尖创新中心和北航生物与医学工程学院。中国科学院北京基因组所蒋岚研究员为文章的共同通讯作者,在识别VEGFA和MINK1两个关键基因方面提供了重要帮助;该研究病人样本由北京大学肿瘤医院提供;文章的其他主要共同作者包括,清华大学任天令教授,北京航空航天大学樊瑜波教授,中国科学院生物物理研究所娄继忠研究员。

论文信息:

High-Throughput DNA Tensioner Platform for Interrogating Mechanical Heterogeneity of Single Living Cells

Xinxin Hang, Shiqi He, Zaizai Dong, Yun Li, Zheng Huang, Yanruo Zhang, Hong Sun, Long Lin, Hu Li, Yang Wang, Bing Liu, Nan Wu, Tianling Ren, Yubo Fan, Jizhong Lou, Ruiguo Yang, Lan Jiang*, Lingqian Chang*

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DOI:10.1002/smll.202106196

文章链接: https://doi.org/10.1002/smll.202106196