Small Methods:基于质粒DNA模板利用CRISPR/Cas9技术提高嵌合抗原受体在人原代T细胞中定点整合效率

以嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗为代表的免疫细胞过继疗法作为一种新兴的肿瘤治疗策略,在血液肿瘤的治疗上展现出引人注目的疗效,并在实体瘤治疗中有巨大潜力。目前,美国FDA已经批准了4款靶向CD19和1款靶向BCMA的CAR-T药物用于治疗恶性血液肿瘤。CAR在T细胞中的表达是CAR-T细胞制备的关键。目前已上市的5款CAR-T药物都是通过逆转录病毒或 慢病毒载体将CAR基因整合到人原代T细胞中。但是这些病毒都是在宿主细胞的基因组中随机整合CAR基因,具有潜在的致癌风险。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用同源重组修复(HDR),外源目的基因可以被精准地插入到细胞基因组的特定位点。已有文章报道CRISPR/Cas9技术可以敲除人原代T细胞的TRAC位点,同时携带CAR基因的HDR模板经adeno-associated virus(AAV)导入到T细胞后,可以被定向插入到该位点。 该方法产生的CAR-T细胞与通过RV产生的CAR-T细胞相比,能有效地减少T细胞的耗竭,提高在白血病小鼠模型中的肿瘤杀伤效果,延长小鼠的生存期。然而AAV制备复杂且昂贵,高剂量的AAV有可能会造成人的肝损伤。因此需要开发新的CAR-T制备方法。

2018年,Alexander Marson研究组利用CRISPR-Cas9技术,以线性dsDNA为模板将NY-ESO-1 TCR定点插入到人原代T细胞的TRAC位点,NY-ESO-1 TCR基因的插入效率可达12.3%。但线性dsDNA的制备和纯化复杂,且大规模GMP生产还不成熟。

为解决以上问题,近日,浙江大学医学院孙洁课题组通过在质粒DNA上的 CAR基因同源臂两端增加两个Cas9切割位点(CCS),与Cas9 RNP共同电转到激活的人原代T细胞中,与不带CCS的质粒载体相比,带有CCS的质粒载体基因的插入效率平均提高了8.6倍,在11个志愿者提供的T细胞中检测CAR基因的插入效率为10%-16.8%。

图一:带有CCS和不带CCS的质粒DNAHDR的模板将CAR基因插入到人原代T细胞中。

以质粒DNA为模板得到的CAR-T细胞经过抗原呈递细胞(APCs)刺激一周后可以增殖到50%以上。为了进一步提高基因插入效率,课题组还尝试了不同RNP和质粒的比例,CCS的数量,不同的同源臂长度以及细胞周期相关蛋白(Cyclin D)对CRISPR系统介导的CAR基因插入效率的优化。

接着,课题组将以质粒DNA为模板得到的CAR-T细胞与以AAV为模板产生的CAR-T细胞进行对比,发现两种方法产生的CAR-T细胞在体外杀伤、增殖以及主要功能分子在mRNA和蛋白水平的表达量基本一致。

图二:体外实验对比以质粒或AAVCRISPR系统HDR的模板产生的CAR-T细胞的功能。

最后本研究验证了通过这两种方法得到的CAR-T细胞的在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中的抗肿瘤效果。结果显示两种方法产生的CAR-T细胞在体内具有相似的抗肿瘤效果。为进一步研究基因大小对该系统编辑效率的影响。课题继续缩短质粒载体,同时靶向CD19和CD22双特异性的CAR(2.2kb)双特性CAR的基因插入效率也可以达到10.5%。

本研究开发了一种通过非病毒载体将CAR基因定点插入到人原代T细胞的新方法。通过缩短模板质粒DNA并在基因同源臂序列两端增加2个CCSs实现对人原代T细胞的高效编辑。该方法产生的CAR-T细胞与AAV产生的CAR-T细胞相比无论是从体外的杀伤、增殖以及主要功能分子的表达都基本一致,在白血病小鼠体内的抗肿瘤能力也基本相同。本研究通过非病毒法产生的CAR-T细胞既简单安全又经济,且质粒DNA的GMP生产非常成熟,可以直接应用于临床研究。

浙江大学医学院孙洁研究员,美国纪念斯隆凯特琳癌症中心Michel Sadelain教授和浙江大学医学院周春研究员为论文共同通讯作者,浙江大学基础医学院博士生荆瑞瑞和矫鹏为论文共同第一作者。

论文信息:

Cas9-Cleavage Sequences in Size-Reduced Plasmids Enhance Nonviral Genome Targeting of CARs in Primary Human T Cells

Ruirui Jing, Peng Jiao, Jiangqing Chen, Xianhui Meng, Xiaoyan Wu, Yanting Duan,Kai Shang, Liling Qian, Yanjie Huang, Junwei Liu, Tao Huang, Jin Jin, Wei Chen,Xun Zeng, Weiwei Yin, Xiaofei Gao, Chun Zhou*, Michel Sadelain*, Jie Sun*

Small Methods

DOI: 10.1002/smtd.202100071

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smtd.202100071