Advanced Materials:单细胞免疫印迹分析技术在单细胞融合蛋白共表达方面最新研究成果

转染是研究细胞生物学中特定基因功能的一种基本方法。转染已被广泛用于共表达融合蛋白(目标蛋白与荧光蛋白标签),并已成为评估基因编辑效率、追踪蛋白信号和非侵入性地研究细胞生物学功能的一项重要技术。然而,融合蛋白的不完全共表达经常发生,并产生广泛的假阳性信号,这对传统的转染评估方法提出了严峻挑战。

图一:融合基因不共表达造成假阳性

为解决这些难题,上海交通大学丁显廷教授和谢海洋助理研究员团队在Advanced Materials杂志上报道了一种更强大和可靠的检查转染融合基因的方案,即单细胞转染分析芯片(scTAC)。scTAC允许在数千个单细胞上同时对多目标蛋白进行快速和高通量分析。具体来说,硅烷化玻璃基底通过化学键力与高灵敏度的光点击水凝胶结合,并在边缘涂抹疏水性混合物(甘油和聚二甲基硅氧烷为主要成分)以构建疏水性带。每个水凝胶细胞陷阱都被分配了单独的坐标,细胞被垂直落入陷阱。没有落入陷阱的细胞用清洗液洗掉,在荧光显微镜下记录表达荧光蛋白的单细胞的坐标。然后加入裂解-电泳液,根据分子量分离电场下的蛋白质。在电泳结束时,使用紫外光激发的光敏水凝胶将蛋白质固定在原位。使用荧光抗体检测目标蛋白的表达,随后用共聚焦激光扫描显微镜对感兴趣的蛋白进行分析。与Western Blot和荧光流式分选等传统方法相比,scTAC实现了 “真正的单细胞 “装载和多目标蛋白联合检测,有效地解决了稀有细胞转染后分析的难题。从细胞采集到单细胞蛋白获取的整个过程可在4小时内完成。

图二:scTAC工作原理及流程

技术概述

scTAC检测转染细胞包括四个主要步骤:I. 结合光敏水凝胶制造部分疏水的微阵列芯片。II. 转染的细胞落入单细胞陷阱,并记录表达荧光的单细胞坐标。III. 对单细胞中的蛋白质进行电泳分离,并通过紫外光激发的光敏水凝胶对蛋白质进行原位固定。 IV. 融合基因共表达的质量检查,并通过共聚焦激光扫描显微镜对多靶点蛋白进行定量分析。

应用和目标人群

主要应用于通过在数量有限的基因编辑的细胞中进行多靶点蛋白检测,特别是稀有细胞研究领域,包括但不限于肿瘤干细胞、循环肿瘤细胞、受精卵、神经干细胞和医学诊断。主要目标受众是分子生物学家、发育生物学家、细胞生物学家、医学家,以及其他生命科学界的几乎所有相关研究人员。

优点

整个过程大约需要4小时完成,比传统western标准方案(通常需要24小时以上)时间缩短6倍左右。同时,对于不同的细胞类型或处理条件,可以同时在一张芯片上的4-6个区域同时分析。多个芯片可以平行进行,而且终端检测设备包括但不限于共聚焦荧光显微镜和芯片扫描仪等。芯片体积小,便于长期储存。

图三:融合蛋白共表达情况分析

图四:肿瘤干细胞融合基因的转染

博士研究生李山鹤是该论文的第一作者,丁显廷教授和谢海洋助理研究员是论文的通讯作者。相关研究得到国家自然科学基金,国家重点研究发展计划项目,上海市科技创新行动等项目的支持。

论文信息:

Single-Cell Immunoblotting based on a Photoclick Hydrogel Enables High-Throughput Screening and Accurate Profiling of Exogenous Gene Expression

Shanhe Li, Ze Wen, Behafarid Ghalandari, Tianhao Zhou, Antony R. Warden, Ting Zhang, Peng Dai, Youyi Yu, Wenke Guo, Mofang Liu, Haiyang Xie*, Xianting Ding*

Advanced Materials

DOI: 10.1002/adma.202101108