Advanced Science:利用发卡型crRNA提高CRISPR/Cas13a系统特异性

成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR-associated (Cas)蛋白系统,在基因编辑、分子诊断和RNA干扰等领域具有十分强大的应用前景。CRISPR/Cas13a是一种由单链RNA引导的RNA核酸内切酶,具有快速、准确、高灵敏度和可设计性的分子诊断优势。然而,CRISPR/Cas系统具有很高的脱靶风险,这对于其在实际应用中的准确度和稳定性带来重大挑战。优化crRNA的设计是提高CRISPR/Cas13a系统特异性的重要策略,目前最常见的方法是在crRNA-spacer中引入人为的错配。但由于插入的错配在crRNA中的位置具有不确定性,且其增强机制尚不清楚,此方法对于CRISPR/Cas13a系统特异性的提高具有一定的局限。

近年来,研究表明发夹结构增强了RNA分子的功能,并得到了广泛应用,如链置换扩增反应(SDA)、RNA干扰、适配体生物感应器和RNA折纸等。然而,对于发卡型crRNA在CRISPR/Cas13a系统中应用于分子诊断和RNA干扰的价值,人们知之甚少。

该文中,研究人员提出在Cas13a-crRNA的spacer序列中引入额外的发卡结构,可以提高CRISPR/Cas13a系统的单碱基识别特异性。首先,研究人员通过蛋白质荧光淬灭机制评估了Cas13a蛋白与RNA的结合能量。与普通crRNA相比,优化后的CRISPR/Cas13a系统显示具有较高的靶向亲和力,同时其脱靶活性被抑制。其次,研究人员建立了HBV基因分型平台,具有1aM的高灵敏度(100 copies ml-1),且发卡型crRNAs将Cas13a系统的单碱基差异区分能力至少提高了3倍。整个检测流程耗时约1小时,并且可以在集成在一个反应体系中,操作方便。此外,研究人员对Cas13a蛋白与发卡型crRNA和靶标RNA的相互作用的活性机制进行了分子理论模拟,研究结果表明,发卡型crRNAs与传统的Cas13a系统兼容。

图1  A. 使用发卡型crRNA提高CRISPR/Cas13a系统特异性的原理示意图;B. HBV基因分型检测平台用以验证CRISPR/Cas13a系统的特异性

图2  A.发卡型crRNA的设计原则; B.荧光淬灭机制探索Cas13a蛋白与crRNA和靶标RNA的结合亲和力的流程示意图

上海交通大学生物医学工程学院个性化医学研究院专注于个性化疾病诊断和个性化疾病治疗的研究,主要技术包括疾病早期诊断和生物传感器,单细胞质谱流式技术(CyTOF),组织原位单细胞高吞吐量目标分析(IMC),单细胞蛋白质印迹(scWB),微流体设备罕见病人样品处理等,在痕量生物样本的单细胞蛋白质与核酸检测领域已具备成熟的技术。

博士生柯雨晴是该论文的第一作者。丁显廷教授和郅晓助理研究员是论文的通讯作者。相关研究得到国家自然科学基金、国家重点研究开发计划、上海交通大学青年人才培养基金、上海市教委科研项目、病原微生物生物安全国家重点实验室开放基金等项目的支持。相关论文在线发表在Advanced Science (DOI: 10.1002/advs.202003611)上。