Advanced Science:综述低温冷冻保存中的冰晶抑制材料、策略及挑战

温度的降低可有效减缓生物体内生化反应,其也是实现活细胞、组织、器官乃至整个生命体长期保存的理论基础。低温保存已成为包括细胞治疗、生物样本库、组织工程与再生医学、生殖医学工程等诸多领域不可缺少的支撑技术。但在低温冷冻保存过程中,在降温冷冻与复温融解过程中无法完全避免冰晶的形成与生长对样品造成的损伤,这已成为制约样品低温保存效率与质量的关键技术瓶颈。如何实现对低温保存过程中冰晶形成及其生长的有效抑制,降低其对保存样品造成的损伤,是包括低温生物学在内的诸多学科共同关注的热点问题。

近年来,随着化学、材料、工程和生命等多学科的蓬勃发展和交叉共融,冰晶抑制的方法和策略层出不穷。基于此,中国科学技术大学赵刚课题组首次从分子材料遴选与设计、工程化策略与结构仿生手段、多物理场协同调控相结合的角度,全方位、多层次地概述了冰晶抑制的方法和策略,对现代低温生物学的发展,特别是生命材料的深低温冷冻保存技术的革新具有重要的指导意义。

该综述首先介绍低温保存的基本背景与意义,并重点强调在低温保存的降复温过程中由于冰晶的形成与生长对冷冻保存样品所带来的损伤。当前的低温冷冻保存主要有两种方式:一种慢速冷冻方式,这种方式会促使降温过程冰晶形成对保存样品造成机械损伤,此外复温过程冰晶再结晶也会对保存样品产生破坏;另外一种保存方式是玻璃化保存方法,利用高浓度的保护剂(cryoprotectants,CPA)以及超快速降温冷冻可以促使溶液在降温过程中形成玻璃态,避免降温过程中冰晶形成,但是含有高浓度的化学保护剂的溶液会在复温过程不可避免的发生反玻璃化,进而对样品造成致命的损伤。可以看出,无论是在降温还是复温过程,胞内冰与胞外冰的形成与生长是造成保存样品损伤的关键因素,因此亟需降低冰晶对保存样品的损伤从而提升冷冻保存质量与效率。

图1. 低温保存基本流程. A. 低温保存的基本过程以及冰晶损伤机制;B. 依赖于冷冻速率的低温损伤;C. 不同冷冻速率下的细胞体积响应;D. 降复温过程中的冰晶损伤;E. 胞外冰与胞内冰实物图.

针对冰晶抑制材料方面,作者首次提出化学抑冰分子的概念,研究人员首先重点总结分析了当前抑制冰晶形成与生长的材料,特别分析了其限制冰晶的内在分子机制,以及其在低温保存中的应用。冰晶抑制材料主要包括保护剂、抗冻(糖)蛋白、纳米材料、合成聚合物以及水凝胶等。

图2. 用于抑制冰晶材料的发展历程

然后总结了用于冰晶抑制的多种工程化策略以及它们在低温保存中的应用,包括胞内递送、细胞封装以及仿生结构设计。针对胞内递送,作者重点探讨了多种响应性纳米材料封装海藻糖用于胞内递送,降低胞内冰损伤;以及研究人员基于多种封装方式以及装置设计,例如离心微流控技术、静电喷雾等,设计出多种微胶囊以及微纤维结构,可以大大降低胞外冰晶损伤,防止冰晶延伸至细胞内部,提高其保存效率;此外,受大自然独特的结构启发,研究人员从仿生结构设计角度出发,总结了当前可以用于防止冰晶损伤的多种仿生结构,例如卵细胞独特的透明带结构,植物细胞的细胞壁结构等。这些独特的结构有望应用在低温保存过程中防止保存样品受到冰晶损伤。

图3. 响应纳米材料封装海藻糖用于胞内递送。A:PH响应材料封装海藻糖;B:不同添加下的细胞保存效率;C:海藻糖胞内递送示意图;D:冷响应纳米材料封装海藻糖的保存效率;E:胞内递送海藻糖保存胰岛细胞用于糖尿病治疗。

此外,研究人员系统地探讨了用于调控冰晶成核、生长以及去除的外部物理场技术,主要包括磁场、光场、电场以及声场,并强调其限制冰晶的内在分子机制以及在生物样品低温保存中的潜在应用。作者重点探讨了磁场在降复温过程用于低温保存的冰晶抑制,特别注意的是,作者课题组2016年率先在国际上开展了用于细胞保存的电磁复温技术,目前电磁复温技术在大尺度组织以及器官保存已经被寄予厚望。

图4. 基于电磁复温技术用于低温保存的重要进程

最后针对当前基于冰晶抑制促进低温冷冻保存技术存在的关键问题以及挑战进行了深入探讨与分析,作者认为如何借助仿生学手段,设计出绿色、无毒的抑冰保护剂对于促进低温保存至关重要。此外,随着多学科的交叉发展,多种工程化策略以及装置的设计,会为限制降复温过程冰晶形成与生长提供新的思路与方法。最后,作者提出当前如何突破大尺度器官与组织保存过程中的冰晶损伤问题仍是低温保存所面临的重要挑战,认为多物理场协同技术或许会为大尺度器官的深低温保存提供潜在的解决方案。

研究人员结合工程学与材料学从多学科交叉融合角度首次系统全面地综述当前低温保存过程中的冰晶抑制的最新进展,对当前低温生物医学学科的发展与进步具有重要的参考价值。相关论文在线发表于Advanced Science (DOI: 10.1002/advs.202002425期刊上