Small Methods:新冠病毒入胞可视化探针与细胞模型

新型冠状病毒SARS-CoV-2在席卷全球,造成了全球性重大公共卫生威胁。快速研制疫苗、抗体和治疗药物成为科学界面临的重大挑战。新冠病毒SARS-CoV-2具备高度传染性和致病性,采用病毒感染模型进行中和抗体及小分子抑制剂的药效评估需要在高等级生物安全实验室中进行,且常需要数天时间才能完成检测,限制了抗体和药物筛选的效率。发展快速、可视、不依赖于活病毒的新冠病毒入胞检测探针和可在常规实验室开展高通量药物筛选的替代细胞模型,对于加速新冠病毒抗体和药物的研究有重要意义。近日,厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心夏宁邵教授课题组,报道了一种基于基因工程重组方法直接制备SARS-CoV-2病毒spike三聚体荧光探针用于活细胞成像检测新冠病毒入胞过程的新方法。

研究者通过CHO真核表达系统高效表达制备出C端融合抗酸荧光蛋白Gamillus的重组新冠病毒spike蛋白STG。STG经SEC和冷冻电镜结构重建确认呈现与天然病毒刺突高度相似的三聚体结构,且与ACE2有很高的亲和力(18.2nM)。为便于图像分析,研究者构建了同时表达H2B-iRFP670(细胞核分布,近红外荧光信号)和ACE2-mRuby3(细胞膜分布,红色荧光信号)的稳定细胞株ACE2iRb3-293T。STG具备良好的细胞相容性和荧光性质,在ACE2iRb3-293T上能被细胞快速结合并内吞,支持one-step和wash-free条件的活细胞荧光成像和单细胞、亚细胞器水平的图像定量分析。基于这一系统,研究者进一步开发了可定量测定感染恢复期血清、疫苗免疫血清中和抗体(入胞阻断抗体)水平的CSBT检测方法。与常需耗费一至数天时间的病毒中和试验相比,CSBT在90分钟内仅需要一步操作即可获得抗体滴度,其定量结果与活病毒中和(r=0.96)、假病毒中和试验(r=0.83)的检测结果呈高度相关。CSBT与病毒中和试验相结合,可用于高通量筛选具有高效入胞阻断作用的单克隆抗体,并解析单抗发挥中和作用的机制。使用这一方法,研究者鉴别出了特异性针对新冠病毒的强中和单抗36H6,同时对新冠病毒和SARS-CoV具有中和活性的广谱中和单抗2B4,以及通过胞内途径发挥中和作用的83H7单抗。

图1. CSBT检测方法的示意图

除了抗体检测评估方面的应用外,该研究发展的探针和模型还可用于筛选分析抑制新冠病毒入胞及胞内转运的小分子化合物。通过分析11种影响胞吞和内吞小体转运的小分子对假病毒感染的抑制作用和对STG内吞荧光表征的关联,研究者发现测量细胞STG内吞荧光MFI比率(STG-IFR)、STG内吞小体的平均面积(STG-IVA)和单细胞STG内吞小体平均数量(STG-IVNs)与化合物抗病毒感染效果高度相关,提示该系统可用于抗病毒小分子药物的高通量筛选。由于该方法不涉及感染性材料,直接采用重组蛋白探针,可在装备于普通实验室的自动化药筛系统上应用于针对新冠病毒入胞的大规模药物筛选。研究者还证明,该方法可拓展用于建立SARS-CoV、MERS-CoV等其他冠状病毒的可视化入胞模型。

图2. 新冠病毒入胞可视化探针与细胞模型

该工作建立了不涉及使用感染性材料的新冠病毒入胞可视化探针与替代细胞模型,为中和抗体、疫苗免疫力和入胞阻断小分子药物的筛选和评价提供了新的方法,也为深入解析新冠病毒感染细胞的机制提供了可视化分析工具。这项研究以“Virus‐Free and Live‐Cell Visualizing SARS‐CoV‐2 Cell Entry for Studies of Neutralizing Antibodies and Compound Inhibitors”为题发表于Small Methods (DOI:10.1002/smtd.202001031)。