Advanced Therapeutics:应用CRISPR/Cas13构建外泌体PD‐L1高灵敏生物传感器,用于免疫治疗中肿瘤进展的动态监测

外泌体是由大多数类型细胞分泌的一种胞外囊泡,具有脂质双层膜结构,直径在30-150nm左右,内含核酸、脂质和蛋白质等。研究表明外周血肿瘤特异外泌体中表达的异常蛋白质与肿瘤母细胞高度一致,能够揭示其来源细胞的分子指纹和细胞状态。这些特征使得外周血外泌体成为一个潜在的良好的循环生物标志物库。然而,外泌体由于体积小,浮力和密度低等因素,使得外泌体蛋白的分离和定量检测面临挑战。目前,一些常规检测分析外泌体蛋白质的方法包括蛋白印迹(WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和质谱分析等。这些传统检测外泌体蛋白的方法通常需要纯化外泌体,处理过程繁琐,样本量使用较大,同时灵敏度不高,不适合外泌体微量蛋白质的检测。近年,新一代的生物传感器检测外泌体正在陆续被开发,比如,微核磁共振传感器(NMR), ExoSearch芯片和纳米等离子外泌体传感器。但是这些技术方法复杂或传感器制造复杂,开发一种高灵敏,便捷且适合临床应用的外泌体微量蛋白检测方法是非常有必要的。

目前,核酸检测技术飞速发展,为构建外泌体高灵敏度分析平台提供了借鉴。重组酶聚合酶扩增(RPA),它利用重组酶促进寡核苷酸引物插入双链DNA分子的互补序列中,并在37-42℃恒温下指数扩增靶DNA1。TMA是一种RNA转录介导的扩增系统,在T7转录酶作用下产生RNA扩增子2。Cas13a蛋白与靶RNA结合后在crRNA介导下活化,活化的Cas13a不仅切割靶RNA,而且通过旁切效应切割附近其他RNA3。在体外,利用Cas13a的旁切效应,在体系中加入RNA报告探针,通过 Cas13a 对RNA报告探针的非特异性旁切割产生荧光信号,可高灵敏实时检测特定的RNA靶分子4, 5

核酸适配体是一段短的寡核苷酸链(10-100nt左右)6,通过SELEX 技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment,即配体指数富集系统进化)7从人工合成的ssDNA或RNA 文库中筛选得到,能够高亲和性和高特异性地与各种靶标结合。核酸适配体特异性结合靶蛋白为检测蛋白信号转为检测核酸信号提供了理论和物质基础。

中山大学附属肿瘤医院刘万里和曾木圣团队利用适配体和恒温扩增新技术建立了一种名为Aptamer-RPA-TMA-Cas13a(ARTCA)的新方法,该方法可直接检测血清外泌体PD-L1,检测限为10颗粒/ ml。研究人员使用DNA适配体与外泌体膜上PD-L1蛋白特异性结合,洗涤去掉未结合的DNA适配体后,通过RPA-TMA技术恒温指数扩增DNA适配体,将蛋白信号转为核酸信号,同时使用CRISPR / Cas13a实时检测RPA-TMA扩增产物,从而推算外泌体膜上PD-L1蛋白含量。血清外泌体中的PD-L1蛋白水平与患者肿瘤组织中PD-L1表达水平相关,免疫治疗前后肿瘤患者血清外泌体PD-L1蛋白水平升高预示治疗效果不佳,而水平下降预示疗效好。利用ARTCA可以高灵敏度便捷动态监测血清外泌体PD-L1变化,为接受免疫疗法的肿瘤患者临床预后判断提供一个实时的指示器,同时,ARTCA平台也拓展了CRISPR技术的应用。

相关工作在线发表在Advanced Therapeutics上。(DOI:10.1002/adtp.202000093)