Small:以CRISPR-Cas13为基础的光控RNA m⁶A编辑新策略

基因编辑技术是研究分子功能的重要工具,同时具有广阔的应用前景。DNA编辑工具主要包括锌指、TALEN以及CRISPR 系统等。目前开发的II型CRISPR-Cas9和V型Cas12系统,能够解析特定基因元件的功能并纠正致病突变。(1-3) 另一方面,RNA在复杂而动态的细胞环境中也起着重要作用。 VI型CRISPR-Cas13系统可以靶向RNA,从而在RNA水平调控生物学过程。m6A and A-to-I是两种最主要的RNA修饰方式,基于CRISPR的m6A效应蛋白或RNA腺苷脱氨酶(ADAR)可以实现对RNA的特异性编辑。(4-7) 此外,RNA靶向系统CIRTS与CRISPR相比体积小、免疫原性低,更有利于在RNA水平操控生命活动。(8) 这些新方法不仅扩大了RNA编辑的范畴,还促进了我们对表观转录组学的理解。但是,这些方法均无法实现对RNA编辑活性的精确时空调控,这对于理解单个转录本的动态功能以及在转录水平与细胞表型之间建立因果关系是至关重要。

天津大学天津医院马信龙课题组针对这一问题,利用光遗传学技术,对RNA编辑的精准时空调控问题进行了一系列探讨。相关论文在线发表在Small上 (DOI: 10.1002/smll.201907301)。该工作以靶向RNA的CRISPR-Cas13为基础,构建出新型光控RNA m6A编辑工具—PAMEC,该工具由RNA锚定元件,效应元件和向导RNA三种组分组成,可实现m6A的特异性编辑。之后研究者还结合MS2适配体和上转换纳米技术,证明该方法可以用于调控细胞生物学过程并具有活体RNA编辑的潜力。

为构建光控RNA m6A编辑工具,研究者首先将蓝光响应光敏蛋白CIBN和CRY2PHR分别与失活型Cas13(dCas13)和m6A效应元件(m6A writer或eraser)相融合。体外实验证实,在向导RNA的引导下,PAMEC-1(m6A eraser)和PAMEC-2(m6A writer)均可实现m6A的光控编辑;研究还发现PAMEC-2介导的m6A修饰能够影响RNA decay过程。之后研究者为了提高PAMEC系统的效率,在向导RNA骨架序列后引入MS2适配体序列,并对dCas13进行工程改造,构建出PAMECR系统,通过MCP蛋白招募更多效应元件,在体外实验中实现了更高效率的多重基因m6A编辑。

有鉴于蓝光的组织穿透性有限,研究者利用PDMS-上转换纳米颗粒薄膜,将980nm近红外光转换为蓝光,表征实验证明该体系具备良好的稳定性及发光性能。(9) 而后在体外实验中对其进行检测,结果显示PDMS-上转换纳米颗粒薄膜能够有效激活PAMECR系统实现多重基因的m6A编辑。

最后,研究者利用该工具编辑特定基因m6A水平以调控细胞生物学过程,结果显示,PAMECR-1能够显著编辑靶基因Pth1r的m6A水平,从而促进干细胞向成骨细胞分化。这一结果表明PAMECR系统通过编辑RNA m6A,能够在复杂生物学过程中发挥重要调控作用。

总体而言,该研究成功构建出以Cas13为基础的光控RNA m⁶A编辑新工具—PAMEC。与既往的RNA编辑工具相比,PAMEC能够实现时空特异性的m6A编辑,结合上转换纳米技术可以将其光学操作窗进一步扩展,这对于未来进一步深入研究RNA功能及开发活体治疗策略至关重要。