Small Methods:Aerolysin纳米孔道灵敏识别单个Tau蛋白相邻磷酸化位点

Tau 是一种主要在脑细胞中表达的参与稳定微管的相关蛋白,其异常过度磷酸化在神经退行性疾病(如阿尔兹海默症)中起着关键作用。在正常及阿尔兹海默症病人脑组织中已发现了41个丝氨酸、28个苏氨酸以及4个酪氨酸存在磷酸化修饰。尽管质谱、免疫沉淀等多种技术已被用于检测Tau蛋白的磷酸化,然而Tau蛋白上相邻氨基酸磷酸化修饰的精准识别仍具有挑战。

生物纳米孔道作为近年来最具发展潜力的单分子分析方法之一,已成功应用于商业化DNA测序中。然而,在蛋白质相关单分子检测中,仍缺少高灵敏纳米孔道测量界面以及相应测量方法,仅能通过额外引导链修饰来放大单个蛋白质/多肽分子上单个磷酸化修饰所引起的电流信号的差异,难以实现对单个多肽分子上多个磷酸化修饰的直接测定,更无法区分多个相邻磷酸化位点。南京大学生命分析化学国家重点实验室龙亿涛课题组在前期纳米孔道电化学单分子分析研究中,发现了具有独特天然结构的野生型Aerolysin纳米孔道,应用于单个DNA及多肽分子的单磷酸化修饰位点测量。结合对Aerolysin纳米孔道灵敏区域的深入解析,该团队构建了一系列突变型Aerolysin,于近期获得了具有双作用位点的T232K/K238Q aerolysin生物纳米孔道测量界面,实现了在单分子水平对tau片段的Ser262磷酸化,Thr263磷酸化及Ser262/Thr263双磷酸化位点的灵敏识别。该突变型Aerolysin纳米孔道不仅提高了K238Q所在传感区域的能垒,还大大增强了T232K位点与单个磷酸化多肽分子的静电相互作用力,使得单个多肽分子穿孔速度有效降低,达到了5-70 ms每个氨基酸,是目前已报道多肽过孔速度最慢的生物纳米孔道。与野生型aerolysin纳米孔道相比,在+100mV下不同tau片段分子在孔道内的识别持续时间延长了44-612倍,从而使得待测多肽分子具有高度均一的特征电流,可在混合体系中对不同磷酸化程度的tau片段实现接近100%的识别分辨。双灵敏作用位点生物纳米孔道测量界面有望进一步实现对天然氨基酸及其翻译后修饰的特异性分辨和单分子蛋白质序列的精准获取。

相关论文以“T232K/K238Q Aerolysin Nanopore for Mapping Adjacent Phosphorylation Sites of a Single Tau Peptide”为题发表在Small Methods(DOI:10.1002/smtd.202000014)杂志上。