Advanced Science:丙烯腈介导的单碱基分辨率新生RNA测序法及其在RNA动力学研究中的应用

RNA测序技术的快速发展极大地推动了人们对基因调控的认识,通过高通量检测细胞内稳态RNA的表达水平,及表达水平对各种生物过程或外界刺激的响应变化,RNA测序技术可以解密生物体内的基因调控机制。但是传统的RNA测序技术时空分辨率低,不适用于研究瞬时RNA动力学,无法区分直接受调控的基因和间接受调控的基因,导致很难从观测到的基因表达信息中分析出直接调控机制。新生RNA测序能够解决上述问题。和传统的RNA测序方法相比,新生RNA测序并不检测稳态RNA,而是检测新转录生成的RNA,因此在研究RNA瞬态动力学时,新生RNA测序具有更高的分辨率。一种常见的新生RNA测序的方式是通过代谢碱基,比如s4U,标记实时转录的RNA(新生RNA),再利用亲和富集纯化的方式,通过靶向代谢碱基,分离富集总RNA中的新生RNA片段。但是纯化富集的方式往往会向导致实验偏差,并且富集过程中的非特异性吸附作用很难完全消除。武汉大学化学与分子科学学院周翔教授团队发明了一种新型的单碱基分辨率新生RNA测序法AMUC-seq,单碱基分辨率的特性允许该方法从稳态总RNA的测序信息中追踪新生RNA信息,从而直接提取新生RNA测序片段,而不需额外分离富集新生RNA。

该方法利用丙烯腈诱变掺入新生RNA中的s4U,向新生RNA中引入特定的U-to-C碱基突变。在碱性环境下,通过Michael 加成,s4U的巯基可以被亲电体丙烯腈烷基化,该烷基化导致s4U的N3从质子给体转变为质子受体,从而导致s4U的碱基配对方式从与T配对转换为与G配对。基于这一转化,在RNA测序信息中,新生RNA中s4U掺入的位置将会出现U-to-C碱基突变,追踪该突变信号即可提取新生RNA信息。该种化学方法的反应效率可达90%,并且对其他碱基几乎无损伤。

在应用 AMUC-seq检测全转录组的mRNA半衰期,验证该方法适用于转录组RNA动力学研究后,该课题组又应用AMUC-seq研究了G-四链体稳定剂PDP,一种潜在的抗癌药物,在人类细胞中的直接基因靶标。通过检测哪些基因的新生RNA转录水平在短时间内受到该药物的抑制,成功的验证了该药物的近千个直接基因靶标。这些基因中明显富含癌症相关基因(如SRC和HRAS)。此外,该团队还发现稳定细胞内的G-四链体结构能够干扰mRNA的聚腺苷酸化过程,这可能是G四链体靶向药物的另一种潜在的抗癌机制。