Small Methods: 细菌中CRISPR基因编辑技术的开发指南

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,简称CRISPR)是一种广泛存在于细菌及古生菌中的特殊重复序列,其中的间隔(Spacer)序列往往能与外来质粒或噬菌体相匹配,其转录产物与CRISPR的临近序列编码的Cas蛋白一同发挥作用,切割与之匹配的入侵DNA序列。CRISPR/Cas系统因此被视为细菌中原始的获得性免疫系统。通过人为设计间隔序列,CRISPR/Cas系统可被工程化为由RNA引导的可编程核酸酶,服务于基因编辑过程中。目前CRISPR基因编辑技术已经在大量的高等动物和植物中获得了成功,例如人类体细胞及胚胎、小鼠、猴、拟南芥和水稻等。在真核细胞中CRISPR/Cas系统能够在人为设计的特异性位点引入双链DNA断裂,而后细胞中的非同源末端重组系统(Non-homologous end joining,简称NHEJ)将以一种易错的方式重新连接断裂的DNA,形成局部序列的缺失或插入,其结果往往会导致靶基因的失活。若人为提供修复模板,则细胞将以模板为参考,精确的修复断裂的DNA。CRISPR基因编辑技术在高等动物和植物中的快速推广得益于真核生物中成熟且高效的DNA重组系统和综合的DNA断裂修复机制。与之相对,若在细菌中单独使用CRISPR/Cas系统来人为制造双链DNA断裂,其结果往往是细菌的死亡,并不能达到基因编辑的目的。这是因为大部分细菌缺乏有效的DNA断裂修复机制。这也限制了CRISPR基因编辑技术在细菌上的发展。

近期,上海科技大学物质科学与技术学院季泉江教授研究团队发表了题为“Strategies for Developing CRISPR-Based Gene Editing Methods in Bacteria”的综述文章,全面总结了细菌中利用CRISPR技术进行基因编辑的前沿研究进展,同时为在细菌中开发新的CRISPR基因编辑方法提供了技术指南。该论文近期在线发表在Small Methods杂志上(DOI: 10.1002/smtd.201900560)。

基因编辑工具对于研究病原细菌关键致病表型背后的遗传学背景,或改造工业菌株的代谢通路以生产精细化学制品都至关重要。而长期以来,细菌中的基因编辑方法却相当有限、通用性较差、操作耗时且费力。CRISPR基因编辑技术的出现大幅简化了在细菌中进行基因编辑的难度。该论文首先列举了目前在细菌或古生菌中已发现的六种类型的的CRISPR/Cas系统,并着重介绍了在基因编辑中已有较广泛应用的Cas9和Cas12a蛋白的结构基础与其作用机制。之后该文着重探讨了在细菌中使用CRISPR/Cas系统可能会出现的剪切逃逸和核酸酶毒性问题及其解决策略。大部分细菌缺乏有效的DNA断裂修复机制是限制CRISPR基因编辑方法在细菌中应用的主要原因。该文首先介绍了细菌中的内源同源重组系统如何修复CRISPR/Cas工具造成的DNA断裂及利用内源同源重组系统的缺陷。之后分别介绍了辅助重组系统和异源非同源末端重组系统在细菌中修复DNA断裂中的应用。在细菌中完成基因编辑之后需要消除工具质粒,以方便二次编辑或其他下游工作。该文列举了温度敏感性复制子和负向筛选标记在质粒消除中的应用。除此之外,不具备DNA剪切活性的CRISPR/dCas工具在细菌中也有广泛的应用前景。该文介绍了CRISPR/dCas工具在细菌中进行代谢通路改造、控制病原细菌毒力或耐药性、以及建立基因敲减文库的应用实例。同时该文还综述了碱基编辑器在细菌中的应用优势和限制,以及最新发现的由CRISPR/Cas系统引导的转座子在细菌中建立敲除文库的前景。作者相信,未来更多CRISPR/Cas工具的发现与改进必将为细菌基因编辑技术带来更多革新。

该论文的第一作者为上海科技大学物质科学与技术学院博士后吴兆韡,通讯作者为上海科技大学物质科学与技术学院季泉江教授。该课题得到了国家自然科学基金(21922705,91753127和31700123)、上海市科学技术委员会(19QA1406000 和 17ZR1449200)和中国博士后科学基金(2019M651627)的资助和支持。