Small Methods:单细胞水平DNA表观遗传学修饰检测的技术进展

哺乳动物细胞基因组DNA上存在多种类的修饰碱基,包括5-甲基胞嘧啶及其氧化衍生物。通过特异的酶学转化或者化学标记手段,高通量测序技术已经在组织或细胞系水平上分别实现对各种修饰碱基分布图谱的鉴定。近些年,单细胞测序技术的发展实现了在个体细胞水平上探究表观遗传修饰的细胞异质性以及追踪细胞分裂、分化过程中的动态变化。

来自北京大学的伊成器课题组主要关注核酸修饰碱基的生物学功能并开发了系列测序技术,他们在本文中总结了过去十几年间迅速发展的单细胞DNA表观遗传学修饰测序技术,并简要介绍了近期报道的多篇小量免亚硫酸氢盐处理的测序技术文章。

①单细胞5-甲基胞嘧啶测序技术:亚硫酸氢盐测序技术是甲基化测序的金标准,但受限于其苛刻的化学处理条件,投入实验的DNA会产生严重的损伤降解。由于目前还没有可以直接替代的技术,所以目前报道的单细胞甲基化测序技术都是基于亚硫酸氢盐处理。基于不同的文库构建策略和扩增手段,在单细胞水平上可以覆盖到的基因组范围和区域也是不尽相同。近期来自俄勒冈健康与科学大学的课题组结合转座酶打断和组合信标技术(combinational barcoding)将单细胞甲基化测序的细胞通量提高到1K以上,并将其应用到哺乳动物神经细胞亚型的鉴定上。

②单细胞5-甲基胞嘧啶氧化衍生物测序技术:5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶与5-羧基胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶在细胞内的氧化衍生物。虽然基因组上丰度较低,但同样具有重要的表观遗传学功能。2016年,荷兰Hubrecht研究所首先报道了5-羟甲基胞嘧啶的单细胞测序技术,该技术避免了使用亚硫酸氢盐处理,而是采用了一种可以特异性识别并切割修饰位点的限制性内切酶来鉴定得到单细胞分布谱图。伊成器课题组则首次报道了单细胞水平上5-醛基胞嘧啶的测序技术并探究了哺乳动物早期胚胎过程中该修饰分布的动态变化。

③小量样本免亚硫酸氢盐测序技术:近期,来自英国牛津大学的Chunxiao Song课题组报道了可以在最少1ng的基因组DNA上检测甲基化分布的免亚硫酸氢盐测序技术。该技术结合酶学氧化与硼烷化合物还原反应,将5-甲基胞嘧啶高效转化为二氢尿嘧啶,进而通过测序被鉴定得到。同一时间段,来自宾夕法尼亚大学的课题组利用一种高效的脱氨酶实现了对5-羟甲基胞嘧啶在神经细胞基因组上准确定位。同样基于免亚硫酸氢盐处理的测序策略,伊成器课题组结合温和的化学氧化与特异性的标记反应,发展了一种可以在小量样本实现5-羟甲基胞嘧啶全基因组精准定位的测序方法。

同时,本篇综述文章还重点关注了相关技术在临床医学以及生物学研究上的应用前景。相关文章在线发表在Small Methods(DOI: 10.1002/smtd.201900137)上。