Small methods: 闪亮的新剪刀-CRISPR/Cas9基因编辑新方法

CRISPR/Cas9系统由于其简单和高效的特性而成为编基因编辑的首选方法。在向导RNA(guide RNA, gRNA)的指导下,Cas9蛋白能够切割细胞特定的DNA序列,通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)进行修复,从而实现基因编辑的目的。

为了进一步扩大CRISPR/Cas9体系的使用范围,德累斯顿工业大学的Frank Buchholz博士及其同事表达并纯化一系列Cas9荧光蛋白(Cas9-FP)以及dCas9(“核酸酶死亡”型Cas9)蛋白。这些Cas9荧光蛋白和dCas9蛋白含有核定位信号,并与gRNA形成复合物,以核糖核蛋白复合物(RNP)的形式转染进入组织培养细胞,小鼠胚胎干细胞和蝾螈胚胎。如图所示,与对照组胚胎(下图)相比,注射了靶向Tyr基因的Cas9蛋白的蝾螈胚胎(上图)由于Tyr基因的缺失导致眼部色素沉着丧失(白色箭头)。此外,该论文还介绍了一系列的试验性实验,将Cas9蛋白与不同的信号肽组成融合蛋白,研究在不需要转染试剂情况下的如何将其“转运”进入细胞。

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将Cas9蛋白以RNA形式直接转染进入细胞既能增强目标基因的靶向性又减少了脱靶效应。此外将成功转染的细胞通过荧光激活细胞分选技术(FACS)进行富集,进一步提高了基因打靶效率。

相关文章发表在Small Methods (DOI: 10.1002/smtd.201600052)上。

 

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Challenges for Sensitive Quantification of Gene Editing “Off-Target” Activity