[好文章,你推荐!]Perseverance is an art

武汉大学化学与分子科学学院化学基地班孙德恩推荐的文章

文章题目为:Lysosomal pH Rise during Heat Shock Monitored by a Lysosome-Targeting Near-Infrared Ratiometric Fluorescent Probe 

 DOI: 10.1002/ange.201405742

 URL:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.201405742/abstract

Perseverance is an art

一、背景介绍:

作为一名化学学院的本科生,平时在理论课程的学习基础上,也应该对科研前沿进展有所了解,有意识地拓展自己的眼界,为以后的科研道路积累思路和想法。而主要途径就是阅读大量高水平的专业文献。Wiley 旗下有着许多优秀的化学专业或化学交叉学科的杂志,例如Angew. Chem. Int. Ed. 、Advanced Materials、Advanced Functional Materials等等,给我们提供了很好的文献阅读平台,同时Wiley简洁大方、人性化的网页界面也方便了我们的文献搜索、阅读。俗话说:“工欲善其事,必先利其器”,Wiley正是我们的“科研利器”。

笔者对荧光探针、传感器设计有较强兴趣,参与科研工作近两年来,对整个领域略有了解。荧光分析因其具有灵敏度高、选择性好、时空分辨率高等优点,被广泛应用于生物医学分析检测领域。近些年来,由于纳米材料突飞猛进的发展,纳米荧光探针、传感器成为荧光分析领域的热门方向,大有“烈火烹油,鲜花着锦”之势,但其中层出不穷的问题和固有的缺陷,也让我们逐渐警醒:在这个“全民皆纳米”的时代,传统的有机荧光探针有着不可取代的优势,仍然值得我们继续探究。中科院化学所活体分析化学实验室马会民研究员课题组十几年来一直从事有机荧光探针设计策略方面的研究,其中的经验值得我们科研入门者去学习,同时沉下心坚持不懈做研究的精神也值得我们尊重。近期其课题组发表题为“Lysosomal pH Rise during Heat Shock Monitored by a LysosomeTargeting Near-Infrared Ratiometric Fluorescent Probe”的文章,利用有机荧光探针首次揭示在热休克过程中溶酶体的pH值与温度的变化关系【1】。

二、文章概要:

  该文章研究了热休克过程中溶酶体的pH与温度的变化关系。众所周知,热休克等与热相关的疾病严重危害人类的健康。而且,酸性亚细胞器溶酶体的微小pH变化可影响到细胞的自动平衡调节、蛋白质降解、浆膜修复等生理过程。然而,温度与溶酶体pH之间的基本变化关系目前还不清楚,这主要是缺乏相应的有效研究手段。针对这一问题,文中将亚细胞器溶酶体的识别基团引入到稳定的半菁骨架中,发展了具有精确的溶酶体靶向功能、优良的光稳定性以及比率型响应的近红外pH光学探针;结合荧光共聚焦成像技术,研究并揭示出溶酶体的pH随着温度的升高而升高,而且这种升高过程在短时间内是不可逆的。该研究阐明了在热休克过程中溶酶体的pH值与温度的变化关系。

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图1 文章工作脉络图

  首先,作者对探针设计的策略进行了构思:1)必须是具有溶酶体靶向的;2)分析窗口最好在近红外区,使基体自荧光和生物体损伤降到最低;3)抗干扰能力强,可逆性好,能适应生物体复杂基质。然而目前为止,溶酶体靶向的pH探针非常缺乏,商业化探针DND-160较为常用,但是其激发波长低于400nm,存在很大缺陷。因此作者将亚细胞器溶酶体的识别基团引入到稳定、背景荧光低的半菁骨架中成功构建了探针Lyso-pH(如图2)。

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图2 探针Lyso-pH的合成步骤

接下来,作者首先对探针Lyso-pH的光学性质进行了探究,发现探针的吸收光谱和荧光光谱对pH变化响应非常灵敏, 随着pH从4.0变化到7.4,最大吸收峰从598nm红移到681nm(如图3a);635nm激发下,670nm荧光发射峰逐渐降低,同时伴随着708nm处发射峰逐渐升高(如图3b),为比率型(I670/I708)检测打下基础,pH在4.0-6.0之间,I670/I708有着很好的线性关系(如图3c),同时由于探针中酚羟基的质子化/去质子化,在pH 4.0-8.0有着非常好的可逆性(如图3d),这说明该探针与溶酶体的生理条件(pH 3.8-5.0)匹配度高。

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图3探针在不同pH值的缓冲溶液中的a)吸收光谱和b)荧光光谱。c) pH 2.6–9.2范围中探针I670/I708与pH关系图。d) pH 4.0-8.0下的循环实验。(激发波长:635nm)

随后,作者对探针的选择性、抗温度干扰能力、生物相容性以及溶酶体靶向能力进行一一探究。发现探针对除了pH值外的其他干扰物质均无明显响应,在31°C-45°C范围内,荧光信号几乎无变化,说明探针抗温度干扰能力强,同时实验中发现该探针生物相容性优良、靶向能力强、光稳定性好。这说明该探针性质良好,适合进一步操作要求。

作者首先选用Hela细胞和MCF-7细胞作为模型,调节细胞内源pH,建立工作曲线。接着调节细胞的温度,实验组中设定41°C和45°C为热休克温度,对照组中设定37°C,在共聚焦荧光显微镜下观察,能够明显观察到随着温度升高,荧光信号发生变化(图4)。进行在线观测,发现此过程短时间内是不可逆的。由于上文中已经证明探针只对pH变化有响应,因此可以推断出温度升高后,导致细胞内pH变化,进而使荧光信号变化。同时利用事先得到的工作曲线,可以精确地计算出各个温度下对应的pH值。揭示出热休克过程中溶酶体的pH随着温度的升高而升高,而且这种升高过程在短时间内是不可逆的。为了验证探针的效果,作者选用商品化的探针DND-160与之对比,发现探针Lyso-pH性能优于DND-160。作者推测热休克导致的pH变化可能归结于溶酶体膜通透性的改变,为后续工作提供了实验证据。

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图4 溶酶体pH变化与温度之间的关系。a) HeLa细胞 b) MCF-7细胞荧光成像图(不同温度下与探针Lyso-pH孵育20min,激发波长635nm)

三、推荐理由:

我推荐的这篇文章发表在Angew. Chem. Int. Ed.,Angew. Chem. Int. Ed.不用多说,是化学专业的顶尖杂志之一。首先,作者能够将自己的工作发表在这上面,肯定是得到同行评审的肯定。这篇文章利用有机荧光探针首次揭示在热休克过程中溶酶体的pH值与温度变化之间的关系,有以下亮点值得我们学习:

1、选题新且有意义。作为一名本科生,阅读文献是积累想法、思路的过程,一篇好的文献,不仅是选题具有创新性,而且要有实际意义,具有一定的科学价值,不能只是盲目跟踪热点。该文章单纯从有机荧光探针构建上似乎是司空见惯的模式,但是创造性地将温度与溶酶体pH两者结合起来,揭示了热休克过程中的生理变化,为以后该领域的研究打下实验基础,这就将文中的创新性和实用价值体现得淋漓尽致。

2、做科研要严谨细致。该文章无论是探针的构建,还是探针性能的考察和实际应用,都能做到思路清晰,层次分明。实验中做了大量的控制实验、干扰试验,从正面、反面去验证猜想,得出的结论给人一种无懈可击的感觉。我想这是在多年科研实践中积累的经验,值得我们科研入门者去学习。

3、沉下心专注一件事。近年来纳米材料做荧光探针、传感器的文章数量激增,很多人都想在这个领域分一杯羹,荧光分析中真正的科学问题却鲜有人关注。沉下心做科研的人一定是具有前瞻性的,能够预测到纳米材料不能够取代有机荧光探针,因此他们能够只专注于一件事并真正去解决问题。通过Wiley的检索功能,笔者发现该课题组近期在Wiley出版社发表的两篇文章【2、3】,同样是构建有机荧光探针去解决实际问题,创新性强。

Perseverance is an art,我们在看文献过程中,学到的应该不仅仅是文章中的方法技术,更应该去学会去评估文献的价值,去学习文献中所体现出的科学精神,这也是我们科研入门者所要注重培养的素质。

[1] Wan, Q. Q.; Chen, S. M.; Shi, W.; Li, L.; Ma, H. M. Angew. Chem. Int. Ed.201453, 10916–10920. 

[2] Wan, Q. Q; Gao, X. H; He, X. Y, Chen, S. M; Song, Y. C; Gong, Q. Y; Li, X. H; Ma, H. M. Chem. Asian J. 20149, 2058-2062.

[3] Shi, W.; Li, X; Ma, H. M. Angew. Chem. Int. Ed.201251, 6432–6435.