[好文章,你推荐!]基于Toehold引发的滚环扩增对活细胞内miRNA的可视化原位检测

华中科技大学化学与化工学院庄原推荐的文章:

标题:Toehold-initiated Rolling Circle Amplification for Visualizing Individual MicroRNAs In Situ Single Cells

DOI:10.1002/anie.201309388

URL:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201309388/full

我推荐的是清华大学李景虹老师于2014年发表在Angew上的文章“Toehold-initiated Rolling Circle Amplification for Visualizing Individual MicroRNAs In Situ Single Cells”。这是我的导师建议我细读的文章。该文章提出了一种以滚环扩增为基础,通过荧光探针原位检测细胞内miRNA的方法。该方法设计巧妙、简洁,体系简单,易于控制,且验证实验虽然不多却设计巧妙精准,极具说服力。

文章介绍了一种利用滚环扩增反应检测肿瘤细胞内miRNA的方法,称之为TIRCA法。TIRCA法中应用一种哑铃形探针,其环上有一条可调节的toehold,此探针兼作以toehold引导的链置换探针与随后的滚环扩增模板。打开探针后,目标miRNA能够通过滚环扩增延伸上百次。

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图为TIRCA法检测活细胞内miRNA的示意图。哑铃形探针进入细胞后,目标miRNA与哑铃形探针的toehold部分结合,通过链置换,将哑铃形探针转变为激活的环形状态,在DNA聚合酶存在的情况下引发滚环扩增过程,随后与FAM荧光基团相连的另一段短链探针与扩增长链的片段杂交,使长链区域荧光明显增强。若miRNA与哑铃形探针之间存在碱基错配,则滚环扩增无法发生。细胞照片中发生滚环扩增的区域以FAM的绿色标示,蓝色为以染料DAPI标示的细胞核区域。

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图1为toehold长度对TIRCA法动力学的影响。其中图A为TIRCA法体外检测miRNA的示意图;图B为RCA法(使用环形探针)与TIRCA法(使用不同长度toehold的探针)的实时荧光测量结果,let-7a的浓度为1 nM,图中可见TIRCA法相比于普通RCA法的显著优势;图C为TIRCA法中CT1/2对toehold长度作图所得结果。

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图2为toehold长度对TIRCA法特异性的影响,目标miRNA为let-7a,let-7f、let-7c为单碱基错配序列,let-7g为双碱基错配序列。其中图A为520 nm处荧光强度对toehold长度所作的图;图B为let-7a、let-7c、let-7f及let-7g用不同toehold长度的哑铃形探针通过RCA、PRCA和TIRCA法分别所得的ΔFa/ΔFg荧光比值;图C为let-7a、let-7c、let-7f及let-7g的碱基序列。可见该TIRCA法对单碱基错配的检测灵敏度极高,能够特异性地检测到目标物质。

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图3为TIRCA法在A549细胞内对目标miRNA成像的结果评价。其中图A为用FISH法对let-7a序列的成像;图B为用TIRCA法对let-7a序列的成像;图C为用TIRCA法法对阻塞let-7a序列后的细胞的成像;图A-C中,细胞核均用蓝色标示,RCAP标示为绿色,细胞轮廓用虚线标示,插入图为细胞内RCAP的频率分布直方图。显然TIRCA法能够高效准确地通过细胞内成像实现活细胞内的miRNA实时检测,这给检测带来了极大便利。图D为分别用FISH、TIRCA和阻塞let-7a后的TIRCA法处理过的细胞中,单细胞内检测到的RCAP的平均数量。

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图4为TIRCA法在A549细胞内对目标miRNA成像的特异性证明。其中图A-C分别为在为A549细胞内使用完全配对(A)、单碱基错配(B)和双碱基错配(C)的哑铃形探针对let-7a序列进行原位检测的结果,细胞核均用蓝色标示,RCAP标示为绿色,细胞轮廓用虚线标示,插入图为细胞内RCAP的频率分布直方图。图D为分别用完全配对、单碱基错配和双碱基错配的探针通过TIRCA法进行检测的细胞中,单细胞内检测到的RCAP的平均数量。能够看出,TIRCA法对活细胞内目标miRNA的碱基错配有极强的分辨能力,这证明了该方法的灵敏度。

这篇文章通过以上图表条理清晰地论证了文章思路,验证实验均设计巧妙,对结果数据的作图亦清楚直观。此种设计思路值得借鉴。

以上是我的推荐内容,希望能够给大家以帮助。