超分辨率显微镜发展历程

毫无疑问,自16世纪以来,光学显微镜已经历漫长的旅程。首次被知晓的复合显微镜是由Zacharias和Hans Janssen构造的。尽管这些显微镜没有保存下来,但人们确信这些显微镜已能够将放大倍率从3倍提高到9倍。17世纪末期,Leeuwenhoek首次将放大倍率和分辨率提高到细胞水平。他存留下来的显微镜有275倍的放大倍率和令人震惊的1μm分辨率。在19世纪晚期,Ernst Abbe发现光学显微镜的分辨率是由入射光波长和显微镜数值孔径的函数关系决定的。这一发现使分辨极限达到220nm左右。在之后的约一百年内,我们显微镜学家始终停留在这一分辨极限。空间分辨率的限制排除了光学显微镜分辨亚细胞结构如核糖体、囊泡以及其他分子相互作用的可能性,这些物质尺寸均在光学显微镜的分辨能力之下。

20世纪30年代后期,德国科学家Ernst Ruska发明了电子显微镜,它的出现并不久,而Max Knoll推动其分辨率极限低至10埃左右。这是一个不可思议的壮举。不几年后,生物学家就开始利用这种新型的工具。1945年3月,Keith Porter, Albert Claude和Ernest Fullam 在论文“电子显微镜用于组织培养细胞的研究”中发表了第一张单个细胞的电子显微镜照片,文章发表在Journal of Experimental Medicine上。接下来的几十年涌现出大量由生物学家利用TEM揭示详细和复杂超微结构的实验工作。

然而,生物显微镜的目的是了解细胞存活时如何发挥机能。“细胞生命”则是科学家为得到TEM惊人分辨率所需付出的代价。细胞样品要求被固定、脱水、包埋于塑型剂并切成超薄切片。这就产生了一个高度加工和最终长时间操作的样品的二维图像。我们花了很长时间寻找合适的固定剂和缓冲剂,以最大限度地减少人工操作。同样,利用超薄连续切片,目前三维的细胞重构也成为可能,但数据仍然仅呈现一个快照的时间。而生命是动态的,它的周期超过一个快照的时间。

接下来这一领域出现了超高分辨率显微镜。为充分认识动态生命进程,我们需要推进光的分辨率极限,并将荧光和共聚焦成像的先进技术应用于亚细胞水平。我们需要能够应用于活细胞的更高分辨率。1978年,兄弟Thomashe和Christopher Cremer两人在Microscopia Acta上发表了“对具有高分辨率和穿透深度的激光扫描显微镜的思考”。文章中的观测数据开启了在光的衍射极限之下的观测的大门。

所有主要的显微镜供应商,如莱卡、蔡司和尼康,均提供商品化超分辨率显微镜部件,分辨率低至20纳米并非罕见的要求。即使是规模较小运营不久的公司,如犹他州的Vutara,号称有第一款3D超分辨率显微镜,也进军这一领域。这一分辨水平的活细胞成像变的十分普遍,在大量文献中都能看到。

原文:Microscopy and Analysis

翻译:杨霄