简易的显微镜增强细胞成像技术

研究人员已经推出一款快捷、方便的方案流程,将高分辨率荧光成像显微镜、光敏定位显微镜(PLAM)和扫描电子显微镜(SEM)联合起来,从而能够得到各种细胞内的高分辨率图像。

这项技术不仅能够呈现出分子化合物在细胞内的分布,而且使得这种原本极其复杂的实验手段变得更加普及。

在一次关于蛋白在亚细胞空间的精确定位的投标中,来自美国霍华德·休斯医学研究所的研究人员最近开发出一种包含PALM和电子显微镜三维成像技术在内的显微成像方法。

 据本杰明·戈比(Benjamin Kopek)博士介绍,这种方法在荧光标记和超微结构保存方面表现优异,但是需要超分辨光学显微镜和特殊的电子显微镜,这对于很多研究人员来说不太现实。

考虑到这一点,本杰明博士和他的同事修改了使用方案,将3D改为基于超分辨荧光显微镜的2D成像系统,例如在很多研究所经常使用的PALM和标准型SEM。

 首先将能够表达荧光融合蛋白的小鼠成纤维细胞在液氮中冷冻,制备大约100nm的低温样品。

 “二维成像法面临的主要挑战在于为了去除染色引起的电子显微镜成像的伪影,不得不在样品表面覆盖一层甲基纤维素,”戈比解释说,“在使用FIB-SEM时是不存在这个问题的,因为在成像的过程中覆盖层会被切除,但是如果没有FIB,只使用SEM单独成像,则表面的覆盖物只有很薄的情况下才能允许1-2KeV的成像电子穿透样本。”

为了克服这个问题,我们采用聚乙烯醇取代冷冻切片染色方案中的甲基纤维素,从而不再需要进行聚焦离子束烧蚀。

戈比说,染色过程依然保留了PALM成像所必需的荧光染料。

这些组分将和标准的2D PLAM 电镜成像样本一块放在覆盖有80nm金球的载玻片上。

戈比强调说:“样品在PALM成像之后,荧光已经不再是关注点,因此我们可以用更大强度的染色剂和固定液来保持电子显微镜成像中细胞的超微结构。”

小鼠成纤维细胞的PLAM和SEM成像完成之后,研究人员会使用这些金珠登记相应的PLAM和SEM的数据。

他们证实了他们所用的染色和显像方法所得到的结果可与原始的3D方法相媲美,甚至在一些情况下比3D方法还要好,还可以继续应用于一系列其他细胞结构的成像。

A: PALM图像;B: 同区域SEM图像;C: 关联图像

“联合超分辨荧光显微镜和电子显微镜的数据,使得我们能够扩大具有特异蛋白信息的电子显微照片。”戈比说,“我们希望这种方法能够使我们回答更多的生物学问题。”

该研究工作发表在PLOS ONE

 来源:Microscopy And Analysis

翻译:李凤